Залы № 5 и 6 посвящены развитию рельсового транспорта с древнейших времён. Посетить эти залы можно по отдельному билету, в составе экскурсионной группы, при приобретении квест-карты или прокате музейного аудиогида, а также скачав мобильное приложение Музея железных дорог России.

В зале № 5 представлены модели первых локомотивов, действующие макеты паровых машин Герона Александрийского (I век н.э.), Ивана Ползунова и Джеймса Ватта, а также макет первого паровоза Черепановых. Здесь можно увидеть уникальный по техническому и художественному воплощению мультимедийный макет первой в Российской Империи Царскосельской железной дороги, а также предметы из фондов, относящиеся к ней.

Зал № 6 посвящён периоду начала бурного развития железнодорожного транспорта в России. Здесь находится целый комплекс интерактивных мультимедийных инсталляций и обстановочных сцен, которые дополняют предметы из коллекции музея. Среди экспонатов: инструменты, чертежи, документы и предметы из интерьера вагонов. Здесь можно увидеть интерактивную мультимедиа-инсталляцию «Анатомия паровоза серии Щ», послушать звуки железной дороги и запустить инсталляцию «Котёл изобретений». Представлены две интерактивные обстановочные сцены: «Кабинет министра» и «Телеграфистка». В «Кабинете министра» можно изучить документы посредством взаимодействия с сенсорным столом Министра путей сообщения князя Хилкова. За столом с инсталляцией «Телеграфистка» можно попробовать набрать текст при помощи телеграфного ключа. Также здесь можно сравнить, как выглядели купе вагона I класса и вагон IV класса.